佐剂(IACUC)
策略
在基础免疫学和应用免疫学的动物澳门威尼斯人注册网站研究中使用佐剂来诱导或增强免疫反应需要仔细考虑。由于需要相对非特异性的炎症来引发强大的免疫，澳门威尼斯人注册网站研究者必须权衡澳门威尼斯人注册网站研究动物因炎症而产生的潜在、局部和/或全身疼痛和/或痛苦的成本，以及从实验中获得的假定的科学利益。所获得的科学知识的有效性和适用性必须与使用强效炎症剂，特别是完全弗氏佐剂（CFA）可能导致副作用的认识相一致。只要有可能，必须使用CFA的替代方案。1,2然而，在许多系统中，特别是在没有可比替代品的自身免疫性疾病模型的诱导中，使用CFA仍然是科学合理的。
佐剂的使用必须在IACUC方案中进行描述和科学论证，包括剂量、部位和给药频率。应在IACUC方案中描述PI酌情决定的先发制人镇痛，并在给予佐剂时给予。除非有科学依据，否则CFA给药需要镇痛，在这种情况下，动物将被放置在E类。一些注射部位（例如脚垫注射）也可能需要放置在E类和特殊的饲养护理。
免疫间隔取决于澳门威尼斯人注册网站研究目标和动物的反应。如果澳门威尼斯人注册网站研究目标是建立自身免疫性疾病的动物模型，可能需要频繁注射。相反，如果目标是生产用于其他项目的抗体，则建议首席澳门威尼斯人注册网站研究员（pii）定期监测抗体滴度（每两周左右），并相应地调整免疫计划。最后，免疫计划和动物反应也可能取决于抗原的大小和抗原性以及所使用的佐剂。一般来说，注射CFA后再注射不完全弗氏佐剂（IFA）以产生抗体，间隔4-6周。总之，注射应及时分离，尽可能与免疫目标相称。
有许多市售的免疫佐剂。特定佐剂或类型的选择取决于它们是用于澳门威尼斯人注册网站研究和抗体生产还是用于疫苗开发。用于疫苗的佐剂只需要产生保护性抗体和良好的系统记忆，而用于抗血清的佐剂需要快速诱导高效价和高亲和力的抗体。没有一种佐剂是理想的，所有的目的都有优点和缺点。辅助使用通常伴随着不同程度和持续时间的不良副作用。对新型佐剂的澳门威尼斯人注册网站研究主要集中在毒性最小的同时保持最大的免疫刺激。澳门威尼斯人注册网站研究人员应该始终意识到在实验动物中使用佐剂可能带来的疼痛和痛苦。
在此描述所有佐剂超出了本政策的范围。CFA应该是最后的手段，其他人应该先尝试。以下是波士顿大学澳门威尼斯人注册网站研究人员目前在动物澳门威尼斯人注册网站研究中使用的一些方法。
Neisserial名叫
方法
NM PorB（脑膜炎奈瑟菌膜蛋白）或孔蛋白Ag复合物：在第1、14和28天，给药0.05-0.2ml SC于小鼠侧面。
Ribi佐剂之后是IFA
方法
在6 - 10周龄时，小鼠皮下注射10-200ug在200ul Ribi中乳化的Ag蛋白进行免疫。四周后，用相同的银蛋白混合物在IFA中乳化，促进小鼠。小鼠在第二次免疫后3 - 4天被安乐死。
TiterMax
方法
给小鼠注射TiterMax和Ag IP的1:1乳剂200ul。重复一次。
IFA
方法
小鼠每隔两周免疫三次，每次免疫剂量为100ul IFA。最后一次免疫两周后，对小鼠实施安乐死。
程序
弗洛伊德佐剂的替代品（并非详尽无遗）
在符合科学目标的情况下，已知产生较少强烈炎症反应的佐剂必须被考虑作为CFA的替代品。这些可能包括其他微生物衍生的化合物[单磷酰脂质A (MPL，或合成的RC259)， muramyl二肽和三肽（MDP和MTP）， TDM（海藻糖二酸盐）等]，其他乳剂[TiterMax， Montanides， EMULSIGENS, Syntex Adjuvant Formulation (SAF), MF-59，和Specol等]，皂苷（Quil A，和QS-21），铝化合物（如明铝），细胞因子和免疫刺激核酸（如CpG寡核苷酸），脂质体，病毒样颗粒，聚合微球（聚丙交酯共糖酸酯）、纳米颗粒、皮下植入腔室等。4,5,6在许多情况下，这些替代方案能够引起细胞和体液抗体反应，足以用于许多科学目的，而且副作用比CFA常见的副作用少。澳门威尼斯人注册替代佐剂的信息也可以在网上找到（见下面的链接）。
瑞比佐剂系
Ribi佐剂是水包油乳液，其中抗原与小体积的可代谢油（角鲨烯）混合，然后与含有表面活性剂Tween 80的生理盐水乳化。该系统还含有精制分枝杆菌产品（脐带因子，细胞壁骨架）作为免疫刺激剂和细菌单磷酰脂a。三种不同种类的佐剂系统配方可供选择。这些佐剂与免疫细胞膜相互作用，导致细胞因子诱导，从而增强抗原的摄取、加工和呈现。这种佐剂系统的毒性和效力比CFA低得多，但通常会诱导出令人满意的数量的针对蛋白质抗原的高亲和力抗体。
TiterMax
TiterMax代表了新一代的佐剂，毒性更小，不含生物衍生材料。它是基于表面活性剂作用，线性，块状或链的非离子共聚物聚氧丙烯（POP）和聚氧乙烯（POE）的混合物。这些共聚物比许多其他表面活性剂材料毒性更小，并且具有有效的辅助特性，有利于趋化性、补体活化和抗体的产生。TiterMax佐剂与共聚物和可代谢的角鲨烯油形成微颗粒油包水乳液。共聚物涂有乳液稳定二氧化硅颗粒，其允许掺入大量各种抗原材料。佐剂活性共聚物形成亲水性表面，激活补体、免疫细胞，增加巨噬细胞上II类主要组织相容性分子的表达。TiterMax将抗原以高度浓缩的形式呈现给免疫系统，这通常导致抗体滴度与CFA相当或更高。
完成弗洛伊德的辅助
CFA是一种油包水乳液，含有热杀死的分枝杆菌或分枝杆菌细胞壁成分，是增强细胞和体液抗体对注射免疫原反应的有效手段。佐剂活性是CFA中存在的分枝杆菌成分刺激免疫细胞的结果，而CFA和IFA均发生从油性沉积物中持续释放抗原和刺激局部先天免疫反应，从而增强适应性免疫。这种反应的一个重要组成部分是抗原沉积部位的强烈炎症反应，这是由白细胞的涌入及其与抗原的相互作用引起的。CFA的使用对澳门威尼斯人注册网站研究者来说是一种重要的生物资源，必须负责任地谨慎使用，以避免或尽量减少过度炎症的不良影响。CFA可能导致注射部位局部炎症和肉芽肿反应。CFA还会引起更严重的副作用，如慢性炎症、皮肤溃疡、局部脓肿或组织脱落。CFA使用后观察到的其他并发症是继发于油乳剂迁移的弥漫性全身肉芽肿，佐剂相关关节炎，以及极少数的慢性消耗性疾病。
以下指导方针旨在消除或最小化CFA免疫继发并发症。这些程序也适用于其它佐剂的施用。a)无菌技术在制备抗原-佐剂乳剂中的应用；B)注射部位的无菌制备；C)合适的注射技术；D)适当的管理路线和地点；E)注射部位的适当分离；f)在每个注射部位使用较小体积的疫苗均已证明可有效消除免疫后并发症。
抗原制剂必须是无菌的，最好是等渗的，pH值中性，不含尿素、醋酸和其他有毒溶剂。使用聚丙烯酰胺凝胶分离的抗原必须尽可能进一步纯化，或者必须通过仔细修剪减少聚丙烯酰胺凝胶的数量，以尽量减少凝胶碎片引起的继发炎症/刺激的数量。建议在将抗原与佐剂混合之前对抗原进行微孔过滤，以尽可能多地去除外来微生物污染。
CFA中的分枝杆菌通过旋转或摇动安瓿或小瓶重悬。然后使用无菌技术将CFA从安瓿或小瓶中取出。虽然方法可能有所不同，但推荐使用1份或更少的CFA与1份水抗原溶液（v/v）在混合CFA/抗原乳剂时，必须注意防止引入气泡。
虽然含有0.5mg/ml分枝杆菌浓度的CFA配方在市场上可以买到，并且已经被许多澳门威尼斯人注册网站研究人员成功地使用，但建议浓度低于0.1mg/ml，以尽量减少高浓度时观察到的炎症和坏死不建议使用高于市售的浓度，除非有科学依据并得到IACUC的批准。此外，使用含有断裂分枝杆菌细胞而不是完整的杆菌的制剂可能是可取的，因为后者在组织学上无法与活的抗酸细胞区分开。
对于大多数应用，CFA通常仅用于初始免疫，而IFA由于缺乏分枝杆菌，是后续免疫的首选佐剂。连续接种CFA必须有科学依据并得到IACUC的批准。含有丁酸分枝杆菌或结核分枝杆菌H37Ra（一种无毒菌株）的CFAs可在市售。
经验表明，使用适合动物种类和大小的注射量、给药途径和部位（见下表1）可以产生良好的效果，同时最大限度地减少不良副作用。8,9一些注射途径可能比其他途径（例如，皮下注射与脚垫给药）对动物的破坏性更小。在可能的情况下，必须使用最少侵入性的方法来完成实验目标。除非有科学依据，否则必须避免皮内注射和脚垫注射。肌内注射也必须合理。建议将多个注射部位隔开足够的距离，以避免炎症性病变的合并，并且两次接种之间至少间隔两周。除了给药途径外，必须小心选择注射部位，以避免可能影响动物正常活动或处理的区域（例如，在兔子的颈背进行皮内注射）。
提出特殊问题的给药途径
首选的辅助给药途径是皮下注射。替代路由必须在IACUC协议中科学地证明。
1)足部免疫
在需要隔离引流淋巴结作为主要作用部位的特定澳门威尼斯人注册网站研究中，利用足垫对小型啮齿动物进行免疫可能是必要的。实验动物的健康状况必须通过以下措施加以解决：限制注射到脚垫的佐剂-抗原溶液的数量，每只实验动物只使用一只脚，以及在柔软的床上而不是屏风上饲养。在没有提供脚垫接种的具体理由的情况下，该技术不得用于啮齿动物的常规免疫。“美国国立卫生澳门威尼斯人注册网站研究院的其他澳门威尼斯人注册网站研究所已经成功地证明，通过在脚垫近端的皮肤发际线边缘（跗骨外侧区域）进行皮下注射，可以获得相同的淋巴引流，这被认为可以避免大部分疼痛，部分原因是它不是一个负重、高度敏感的结构。”具有潜在引流淋巴结功能的10个备选部位包括飞节（腘窝淋巴结10）和颈椎部位（耳穴淋巴结；11个颈浅淋巴结12）。如有科学依据，建议小鼠足垫最大注射量为0.01 ~ 0.05，大鼠足垫最大注射量为0.10ml兔子不能在脚上接种疫苗，因为它们没有真正的脚垫。
2)腹膜渗出物
通过腹腔内注射抗原和佐剂产生啮齿动物腹膜渗出液是获得高滴度试剂的一种广泛认可的、有效的科学方法。通过日常监测和缓解腹水压力或终止实验，可以避免腹胀疼痛和由此引起的痛苦的不良副作用。这些方法只能在不能从体外源纯化抗体的情况下使用。通常情况下，小鼠腹腔注射cfa抗原乳剂必须限制在0.2ml以下有关在小鼠体内产生单克隆抗体的指南，请参阅IACUC澳门威尼斯人注册腹水产生的政策。
3)肌内免疫
肌内注射通常在股二头肌或股四头肌进行。当注射到肌肉束时，必须注意避免邻近的神经和血管以及筋膜平面。由于啮齿类动物肌肉量有限，一般不建议对其进行肌肉注射。
注射后观察及处理
接种后监测动物注射部位的疼痛和窘迫或并发症是必要的，必须每天监测至少四周，或直到所有病变愈合。支持性治疗包括局部清洁、抗生素和使用止痛剂。虽然接种后镇痛不是常规需要，但如果观察到明显的疼痛或痛苦，必须考虑到澳门威尼斯人注册网站研究目的，使用麻醉激动剂，混合激动剂-拮抗剂或其他适合物种的药物。甾体或非甾体抗炎药必须谨慎使用，因为它们对免疫过程有直接影响，不推荐使用。
针的大小
所使用的针头必须是与要注射的乳剂相匹配的最小尺寸。
人员安全
处理含有分枝杆菌产物的佐剂可能是实验室人员的职业危害。在结核菌素阳性个体中，意外针头穿刺与临床疼痛、炎症性病变和脓肿形成有关。结核菌素阴性的个体在意外接触CFA后，在随后的结核菌素试验中检测为阳性必须配戴安全眼镜，避免CFA不慎溅入眼睛。建议对动物受试者进行镇静，以避免澳门威尼斯人注册网站研究人员自行注射。
其他的考虑
科学家在制备抗原以配合佐剂在体内给药时，必须意识到可能存在的污染物质和注射剂的其他特性，这些特性可能具有附加的炎症作用。由于未考虑制剂的无菌性、载体pH值过高或纯化副产物（如聚丙烯酰胺凝胶碎片）的存在，佐剂的明智使用可能会被否定。只要有可能，应注意考虑并消除额外的炎症刺激。
表1:cfa抗原乳剂（CFA-AE）在每个部位的推荐用量和给药途径。其他佐剂的注射量也同样适用。
| 物种 |
总体积 |
每个注射部位的最大体积 |
|
总容积限制 |
皮下SC （ml） |
皮内ID （ml） |
腹腔内IP (d) (ml) |
肌肉的IM (b)(毫升) |
拦路贼(毫升) |
| 鼠标 |
<0.3毫升 |
<0.1 |
< 0.05 (a, b) |
<0.2 (b) |
< 0.05 (b) |
0.05 (a, b, c) |
| 老鼠 |
<0.5毫升 |
<0.1 |
< 0.05 (b) |
<0.5 (b) |
< 0.1 b (b) |
0.1 (a, b, c) |
| 兔子 |
<2.0毫升 |
<0.2 |
< 0.05 (b) |
N/A |
< 0.2 (b) |
N/A |
(a)不推荐(b)只有正当理由时才推荐(c)没有正当理由只推荐一只肢体(d)腹腔内给药需要每天监测和缓解腹水压力(e)不适用/不允许在家兔中使用
动物制剂和佐剂管理
1)镇静和先发制人的镇痛
如果只进行一次注射，可能不需要镇静。如果要进行多部位注射，强烈建议镇静；下面是一些麻醉方案的样本。先发制人的镇痛通常是推荐的，并且可以由PI自行决定或根据批准的IACUC协议进行管理。
2)注射部位的无菌制备
该程序与无菌手术的准备相同。
动物注射镇静剂后：
- 将无菌眼膏涂在眼睛上。
- 剃须的面积要大于注射所需的面积。避免啮齿类动物和兔子的颈背。
- 无菌准备剃光的区域，用氯己定或诺伐山（氯己定），从中心开始，以圆周运动向周围工作。然后用70%的异丙醇清洗同一区域，从中心向外围清洗。重复皮肤准备一次，首先使用倍他定或氯己定，然后使用异丙醇如上所述。
3)佐剂给药完成后，将动物放回干净、温暖的笼子中
如果注射了镇静剂，定期观察，直到动物直立并在笼子里活动。
4)辅助人员程序的管理
- 戴上手套，注射佐剂，确保注射部位之间的距离足够，以避免炎性病变的合并。
- 小心不要给自己注射。
- 按照环境健康与安全的要求处理所有佐剂和针头。
5)佐剂给药后动物监测和记录
项目负责人或指定的澳门威尼斯人注册网站研究人员有责任对接种后的动物进行监测，并在有指示时进行治疗。接种后监测动物注射部位的疼痛和窘迫或并发症是必要的，必须每天监测至少四周，或直到所有病变愈合。必须遵守以下指导原则。
每天的观察和任何治疗都必须记录下来，并在接种后的前28天内供波士顿大学动物科学中心（BU asc）的澳门威尼斯人注册审查。
大鼠和老鼠
使用超链接的鼠类术后监测表记录每只注射鼠类的每日检查情况。
兔子
在动物病历中记录每日检查和治疗。动物医疗记录还必须记录手术过程、注射的药物以及镇静和镇痛的使用情况。
查看术后监测表
请访问程序后监测表
参考文献
- 杰克逊，l.r.和J.G.福克斯1995。佐剂和抗体生产的制度政策和指南。机械工程学报，37(3):141-150。
- 2005佐剂和抗体生产：消除与Freund 's complete和其他佐剂相关的神话。ILAR日报》。46(3): 280 - 293。
- A. billau和P. Matthys. 2001。弗氏佐剂在自身免疫性疾病实验模型中的作用模式中华白细胞生物学杂志，70(6):849-860。
- 疫苗佐剂：制备方法和澳门威尼斯人注册网站研究方案。Derek O 'Hagan， T. Humana出版社，2000。DOI: 10.1226 / 0896037355
- 施密特，c.s.， W. J. W.莫罗，和n.a.谢赫。2007。聪明的佐剂。专家疫苗修订版6(3):391-400。
- J. C. Aguilar和E. G. Rodriguez. 2007。重新审视疫苗佐剂。疫苗25:3752-3762。
- 布罗德森，j.r. 1989。与使用弗氏佐剂相关病变的回顾性分析。实验室。动画。Sci 39:400 - 405。
- 格鲁普斯特鲁普-斯科特，J.和D. D. Greenhouse. 1988。美国国立卫生澳门威尼斯人注册网站研究院内部建议使用完全弗氏佐剂的澳门威尼斯人注册网站研究。科学通报30(2):9。
- 斯蒂尔斯，H. F.和M. Q.贝利，1991。弗氏完全佐剂的使用。实验动物20(4):25-31。
- 卡马拉，T. 2007。跗关节免疫：小鼠脚垫注射的人道选择。j . Immunol。方法328:204-214。
- Nierkens， S. et al. 2004。在耳淋巴结试验中使用报告抗原评估药物的免疫致敏潜力。毒物科学79:90-97。
- 韦弗，J.L.等人，2005。评价淋巴结增殖试验检测可能引起免疫介导药物反应的药物的能力。[J]免疫毒理学杂志2(1):11-20。
- 托特，洛杉矶，A.W.邓拉普，G.A.奥尔森，J.R.赫斯勒，1989。弗氏佐剂腹腔免疫小鼠后应激反应的评价。实验动物科学39(2):122-126。
- 查普尔，h.m.和奥古斯特，p.j. 1976。弗氏完全佐剂致人意外伤害9例报告。临床经验免疫；1976年6月；24(3): 538 - 541。
采用自ARAC/美国国立卫生澳门威尼斯人注册网站研究院
历史
生效日期：2022年5月7日下次审核日期：2025年4月7日