小鼠辅助生殖技术（MART）核心

服务包括

• 胚胎冷冻保存
• 精子的低温保存
• 胚胎移植
• 试管婴儿
• 超高速冷冻（玻璃化：胚胎冷冻保存）
• 胚泡互补和显微注射（creation利用胚胎干细胞核移植的基因工程动物模型）
• 玻璃化后桑葚胚培养和囊胚移植
• CRISPR/ES细胞混合囊胚显微外科技术
• 手工胞浆内精子显微注射（手工ICSI）

精子和胚胎的冷冻保存越来越受欢迎，因为它比维持一个群体有很多优点。它的一些优点是，在菌落管理和维护成本上节省大量的资金和时间，防止遗传漂变，以及在发生污染时提供无病原体的备份。

为了在该设施开始一个低温项目，澳门威尼斯人注册网站研究人员被要求提供10只该品系的雄性小鼠和30-50只该品系或其他所需品系的雌性小鼠。雌性的数量将在个体的基础上决定，取决于品种的繁殖记录。如果没有小鼠，MART核心将进行育种以获得所需的动物。这种繁殖将是调查员的额外费用。以下是低温保存项目的时间表。

胚胎冷冻时间

*每轮冷冻保存时间为5天至1周。一个项目所需的轮数将根据背景菌株的繁殖性能而变化。请随时与我们联系，了解您特定项目所需的动物。

澳门威尼斯人注册网站研究者职责：提供10只雄性小鼠（最好是纯合子小鼠）。如果没有提供这些小鼠，而该设施必须繁殖，则调查人员负责相关费用。动物将被转移到MART设施协议，但仍将由LASC在PI帐户下支付笼子费用。调查人员被要求为他们的生产线创建一个备份（例如，将动物送到合作者那里或保留一个繁殖笼），因为在冷冻保存和储存过程中从来没有100%的保证。

机构职责：冷冻保存250或500个胚胎需要材料、时间和人工（由澳门威尼斯人注册网站研究者指定）。当提供纯合子雄性时，该机构将订购雌性（每次冷冻保存10只雌性）并支付住房费用。当需要进行冷冻繁殖时，该设施可由调查人员负责。

时间框架

• 第一天：经前综合症或Hypernova注射。
• 第三天：注射HCG。
• 第四天：进行试管受精。从雄性精子供体中收集新鲜精子（或解冻冷冻精子），从雌性激素供体中收集卵子（或解冻冷冻卵子）。
• 第5天：进行胚胎形态学评分和胚胎移植（ET）。将所有受精（2细胞）胚胎移植到交媾后0.5天的假怀孕雌性体内；每个漏斗平均移植12个胚胎。
• 第24天：幼崽出生。
• 第45天：断奶。
• 第59天：对动物进行病原体检测并转移给调查人员。

动物和精子恢复：澳门威尼斯人注册网站研究人员将需要为MART设施提供至少1-2名男性创始人，从他们身上分离出新鲜精子并用于体外受精，或者提供1-2根冷冻精子。新鲜的精子效果更好，理想的雄性应该是2-5个月大的，并且被证明是优秀的繁殖者。2名男性捐精者倾向于使用我们内部校准的法国吸管从4个附睾中提取8至10根吸管进行冷冻保存；每根吸管应该适合1次试管受精。MART还将提供精子形态、活力和密度评分。

胚胎合合性：MART核心将冷冻保存胚胎，这些胚胎将从WT雌性或任何转基因雌性中获得，取决于澳门威尼斯人注册网站研究者喜欢的胚胎合合性。

免责声明：试管婴儿是一个非常棘手、反复无常的过程，它的成功取决于许多因素。最大的决定因素是所使用的应变或子应变。根据所用动物的品系以及年龄和固有的繁殖性能，成功的差异很大。这种变异在某些菌株的效率为90%到其他菌株的5%之间。因此，MART核心不能保证成功地重新派生或挽救您的线路。如果第一轮试管婴儿失败，MART核心经验丰富，将尽其所能，包括第二次尝试。收取的费用包括试管受精、动物和每日笼子费用，以及所有用品、时间和人工费用。如果体外受精在你的特定品种中不成功，还有其他的选择，核心可以指导你，以拯救你的品种。

基因分型：由于精子会与野生型卵子受精，你的纯合子转基因系或敲除系在体外受精后会变成杂合子，需要杂交才能达到纯合子。

服务包括

• 胚胎移植（新鲜胚胎）
• 胚胎移植（冷冻胚胎）
• 体外受精（新鲜精子）
• 体外受精（冷冻精子）
• 剖腹产和交叉抚养
• 新生儿再分化和交叉抚养
• 超高速胚胎冷冻（玻璃化）

要获得一个完整的表，列出了重新衍生所需的时间表和小鼠数量，请访问“按天重新衍生”。MART核心采用胚胎移植进行再衍生。怀疑携带病原体的动物胚胎从病原体阳性的胚胎供体母亲中取出，转移到无病原体的代孕假孕母亲中。胚胎移植是获得无病原体幼鼠的主要方法。或者，可以使用体外受精和新生儿交叉培养再生来产生无病原体的幼崽。疾控中心建议对任何经病原体检测呈阳性的品系以及从其他机构输入布鲁里大学的任何新品系提供这项服务。

活体小鼠（感染病原体）再生示意图：第1天：向雌性供体注射激素。管理（经前期综合征）或Hyperova：第3天：向胚胎供体雌性注射激素。注射（HCG）并与有生育能力的雄性配对。第四天：检查胚胎供体雌性是否有阴道塞以确认交配。建立无病原体发情雌性与输精管结扎的雄性。第五天：检查发情雌性是否有阴道堵塞以确认交配。从受感染的雌性中分离出受精的2细胞期胚胎，用FHM（液体保持培养基）或M2培养基等洗涤培养基处理，消毒后将胚胎移植到无病原体的交配后0.5天的假怀孕代孕母亲的漏斗中。在胚胎移植后19天，可能无病原体的窝仔出生。幼崽在21天大时断奶。在接近6周龄时，皮毛和粪便颗粒样品提交给IDEXX进行PCR病原体筛选。无病原体幼犬被转移到调查员的无病原体住房。

冷冻胚胎再分化示意图：第1天-建立干净的雌性与输精管切除的雄性。第二天：检查雌性是否有阴道堵塞以确定交配。第3天：解冻1细胞通过桑葚胚。对性交后0.5天的代孕母亲进行试管胚胎移植。或者，在KSOM培养基中培养到囊胚期。将囊胚移植至交媾后2.5天的代孕母亲。无病原体的窝仔分别在胚泡胚胎移植后19天和囊胚胚胎移植后17天出生。无病原体幼犬在出生后21天断奶。在近6周龄时，皮毛和粪便颗粒样品提交PCR病原体筛选。无病原体的幼崽被转移到调查员的无病原体住房。

核心人员可协助我校自产或购买/进口小鼠的繁殖菌落。这包括交配、跟踪群体、应用特殊饮食、创建人口普查和每周更新调查员。不同基因型和品系的小鼠杂交在core的手中已经取得了成功。胚胎和组织收获也是可能的。为了进行这项服务，必须将核心人员添加到具体项目的IACUC协议中。请联系核心询问每个殖民地的费用（取决于每周的工作时间）。

转基因小鼠:将外源基因引入生殖系并对内源基因进行修饰的老鼠。这是通过将DNA构建体显微注射到我们波士顿大学MART设施的单细胞受精卵的雄性原核中来实现的。胚胎可以在代孕母亲体内发育。

或者，基因工程动物模型的创建可以利用基因编辑（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9942237/），使用核酸酶如TALENs和锌指核酸酶（ZNF）的原核或细胞质显微注射；或CRISPR，利用RNA引导的Cas9内切酶和单导RNA （sgRNA）。

另一种创建基因工程动物模型的方法包括经典的卵母细胞去核和基因靶向胚胎干细胞（ES细胞）核移植，或者更容易和可行的是，利用二倍体或四倍体囊胚胚胎显微手术和显微注射进行ES核移植（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11331774/）。在囊胚显微注射之前，将囊胚的内源性基因的生态位腾空，代之以核移植载体（胚胎干细胞细胞核）中携带的感兴趣的外源基因，以产生移植细胞、组织或器官等。BU MART设施提供上述囊胚互补平台。

转基因：将注射的DNA整合到转基因小鼠的基因组中。

始祖系：从老鼠身上衍生出来的小鼠系，其DNA被整合到染色体的特定位置。通过注射一种DNA结构，根据整合位点的不同，可以建立几条方正线。

基因敲除小鼠：由于在胚胎干细胞中靶向插入干扰DNA（通过同源重组）而使特定基因的表达减弱的小鼠。

胚胎干细胞：来源于囊胚（3天胚胎）内部细胞团的细胞，通过同源重组或使用TALENs、锌指核酸酶或CRISPR技术进行基因编辑以及四倍体囊胚胚胎显微手术用于基因靶向（PMCID: PMC2703175）。四倍体囊胚胚胎干细胞核移植也可用于濒危物种的恢复和保护，甚至可能用于灭绝物种的恢复，为地球生物多样性、生态系统完整性和健康的全面恢复奠定基础。

嵌合小鼠：从注入预先设计的胚胎干细胞的囊胚发育而来的小鼠。

1. “被遗忘的桑葚”：玻璃化后桑葚培养和囊胚胚胎移植

MART开发了一种更有效的方法，使小鼠系在冷冻保存后复活，同时保持系的合合性，避免伴随而来的长时间的基因回交。该方法采用桑葚胚期胚胎恢复、冷冻保存、胚胎培养和胚胎移植复活（见https://www.oxfordglobal.co.uk/wp-content/uploads/2021/04/Post-Vitrification-Morula-Culture-and-Blastocyst-Embryo-Transfer-Poster-April-22-2021.pdf），而不是使用着床前胚胎的剩余胚胎，这往往会导致低温保存后小鼠系的恢复效率低下或反复无常。

这种生殖工程技术具有以下恢复优势：

• 效率：玻璃化后桑葚胚培养和囊胚胚胎移植与新鲜精子体外受精、冷冻精子体外受精或激光体外受精相比，可以补充或提高产量，具有100%的分娩效率和显著可靠的终点建立频率，即每次再生项目产生的幼崽数量。我们的初步澳门威尼斯人注册网站研究的产仔率为100%，每次实验都能产生活的幼崽，每次实验（使用桑葚胚）平均有8只健康的幼崽，而常规条件（使用囊胚）每次实验平均有1只幼崽。

• 规模：仅使用桑葚胚培养产生的囊胚的30%，就能达到上述生殖性能。因此，随着剩余70%囊胚的移植，活仔的数量可能会显著增加，高于普遍接受的每次实验至少2个创始体的转基因小鼠生产标准。

• 合子预选-减轻时间和资金限制：值得注意的是，玻璃化后的桑葚胚培养和囊胚胚胎移植可能产生纯合子创始小鼠，以及选择预先选择的等位基因的组合，而冷冻或新鲜精子体外受精只产生杂合子后代。而后者可能需要几代的基因回交，伴随着更长的时间和更大的代价。

• 其他应用：该技术可用于人工辅助生殖以及濒危物种的恢复和保护。

2. 用于细胞、组织和器官移植的囊胚互补

MART最近与波士顿大学再生医学中心合作，在移植澳门威尼斯人注册网站研究中推进了二倍体囊胚互补的体内细胞、组织或器官的生成（https://crem.bu.edu/）。该工具是体外类器官方法的补充，但由于完整的基因组学和体内分化和发育的化学或分子信号传导潜力，可能涉及较少的瓶颈。

该工具的开发涉及采用冷冻保存十年的胚胎干细胞进行四倍体囊胚互补（胚胎显微手术和囊胚显微注射- PMCID: PMC2703175）。所获得的转基因嵌合体来源于129/B6背景的转基因绿色荧光蛋白（GFP+）敲入NKX-B6-01 ES细胞。供体来源的GFP+细胞仅在转基因小鼠的气道中可见荧光，正如假设和预期的那样。

四倍体囊胚胚胎干细胞核移植也可用于濒危物种的恢复和保护，甚至可能用于灭绝物种的恢复，为地球生物多样性、生态系统完整性和健康的全面恢复奠定基础。

3. CRISPR/ES细胞混合囊胚显微外科技术

该方法用于优化CRISPR技术（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9942237/），以创建非脱靶CRISPR生成的小鼠动物模型。MART提供了一种混合CRISPR/ES细胞囊胚显微外科技术，用于在MART的新囊胚互补平台上生成CRISPR生成的小鼠（见上文）。该平台理想地利用预先选择的非脱靶胚胎干细胞克隆进行胚胎细胞核移植，采用二倍体或四倍体囊胚技术作为囊胚胚胎显微手术和显微注射，利用传统的CRISPR构建物将CRISPR生成的小鼠呈现到受精的1细胞小鼠胚胎的原核或细胞质中，避免了意想不到的遗传变异。CRISPR也被用于斑马鱼（https://www.nature.com/articles/s41467-022-28244-5）。

4. 手工胞浆内精子显微注射（手工ICSI）

冷冻保存的精子在液氮中储存多年后会失去活力。ICSI提供了一种“拯救”不动精子的选择，否则不能通过传统的体外受精使卵母细胞受精（用分离精子头注射小鼠卵母细胞的受精和发育|生殖生物学|牛津学术（oup.com））。MART的人工ICSI首先通过柔和的声波从完整的精子（头+尾）产生精子头（精子核细胞）。它类似于常规的胚胎干细胞囊胚微注射，不同之处在于它是在1微滴注射介质中进行的，如HTF（人输卵管液介质），而传统的ICSI需要多达5微滴注射不同的介质，即使在胚胎显微外科专家手中，技术上也是一项繁琐的任务。相反，单个的、不动的精子头被装载在微注射移液管中，以微滴的方式将精子细胞核显微手术注射到卵母细胞的胚膜中。这避免了使用昂贵的ICSI压电钻和危险的汞注射微移液管，以及传统ICSI卵母细胞显微手术所带来的相对具有挑战性的障碍。

所有小鼠都饲养在微隔离笼中，由动物科学中心使用生物安全柜进行笼子处理和更换。菌落健康监测由ASC兽医监督。报告可应要求提供。

在饲养小鼠之前，每位澳门威尼斯人注册网站研究者将接受ASC人员使用动物设施的培训。有关详细说明，请参阅BUASC澳门威尼斯人注册动物训练和设施使用的网页。此外，贸发会议核心的澳门威尼斯人注册将随时提供咨询。

MART还提供生殖和基因工程培训模块：

• 小鼠无菌和生存手术
• 胚胎培养
• 胚胎显微外科和显微注射-显微注射工作站
• 胚胎显微外科移植-漏斗胚胎移植
• 胚胎显微外科移植-子宫胚胎移植
• 体外受精：冷冻和新鲜小鼠精子
• DNA、mRNA、胚胎干细胞胚胎显微注射制备基因工程动物小鼠模型使用CRISPR或TALENs进行基因编辑
• 类器官生成的显微注射
• 用于移植的细胞、组织或器官的囊胚互补
• 胚胎显微外科重建：发育命运评估
• 澳门威尼斯人注册网站研究生实习
• 微型胚胎培养仪器的创建，显微注射，胚胎
• 转移
• 发情的选择
• 输精管切除术手术
• 激素启动：超排卵，包括超排卵
• 利用胚胎培养和胚胎移植制备冷冻保存和复活的胚胎
• 小鼠精子恢复与冷冻保存

• 激光辅助体外受精促进玻璃化加热的C57BL/6小鼠卵母细胞与新鲜和冷冻解冻的精子受精，产生活的幼崽（参见：https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0091892）
• 胚泡互补：四倍体胚泡显微注射近交的Crl:CD1（ICR）、杂交的B6D2F1/Tac和近交的C57BL/6NTac胚胎用于胚胎干细胞衍生小鼠的比较
• 核克隆和四倍体胚胎互补获得的小鼠杂种活力、胚胎过度生长和生存能力
• 实验室小鼠生殖工程手册；熊本大学动物资源与开发中心，日本
• 基因相同的半小鼠胚胎发育及表型变异哈佛医学院生理与生物物理系人类生殖与生殖生物学实验室；文章发表于发展,英国剑桥大学和牛津大学。
• 玻璃化后桑葚培养和囊胚胚胎移植补充了传统的辅助生殖技术：最近MART澳门威尼斯人注册网站研究和发展的一个例子
• 激光体外受精和卵胞浆内单精子注射：胚胎显微外科
• 胚泡显微注射用胚胎干细胞的制备及其互补